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產(chǎn)品名稱：HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit

產(chǎn)品貨號(hào)：KK2601/KK2602         產(chǎn)品規(guī)格：100 Rxns/500 Rxns

KAPA HiFi高保真酶是二代基因工程酶，分熱啟動(dòng)版和非熱啟動(dòng)版，保真性強(qiáng)，活力超高。具有以下特點(diǎn)：

1）超高保真，通過(guò)大規(guī)模二代測(cè)序得出的出錯(cuò)率：2.8×10^-7

2）可以擴(kuò)增各種復(fù)雜模板；

3）擴(kuò)增片段長(zhǎng)，擴(kuò)增基因組可達(dá)15kb，質(zhì)粒DNA或噬菌體DNA可達(dá)18kb；

4）擴(kuò)增速度快，節(jié)省75%以上的時(shí)間；

5）KAPA高保真熱啟動(dòng)酶，含有2中buffer，分別用于常規(guī)模板和高難度模板。

產(chǎn)品描述KAPA HiFi點(diǎn)燃了DNA聚合體是b家族的DNA聚合酶，被設(shè)計(jì)來(lái)增加對(duì)DNA的親和力。不需要輔助蛋白或DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。與野生型b族DNA聚合酶相比，該酶內(nèi)在的高加工性導(dǎo)致在產(chǎn)量、速度和敏感性方面的顯著提高。此外，擴(kuò)增長(zhǎng)片段以及富GC-和at目標(biāo)的能力也得到了顯著提高。該酶與一種專有抗體結(jié)合，在*步變性之前使酶失活。這可以防止在反應(yīng)設(shè)置期間的非特異性放大，增加靈敏度，并提高反應(yīng)效率。在ReadyMix PCR試劑盒中，KAPA HiFi熱啟動(dòng)DNA聚合酶以方便的2X ReadyMix格式提供，包含除引物和模板外的所有反應(yīng)組分。預(yù)混合物包含KAPA HiFi熱啟動(dòng)DNA聚合酶(每25 uL反應(yīng)0.5 U)，在專用反應(yīng)緩沖液中包含dNTPs(每dNTP在1倍濃度下0.3 mM)、MgCl(在1倍濃度下2.5 mM)和穩(wěn)定劑。KAPA HiFi熱啟動(dòng)ReadyMix是專為常規(guī)，高保真PCR，廣泛的目標(biāo)和片段大小。它提供的錯(cuò)誤率大約比野生型標(biāo)簽DNA聚合酶低100倍，成功率和產(chǎn)量比野生型b族(校對(duì))DNA聚合酶更高。此外，與野生型b族DNA聚合酶相比，KAPA HiFi熱啟動(dòng)需要更短的循環(huán)時(shí)間。

1、產(chǎn)品表現(xiàn)

1）超級(jí)保真、靈敏

2）擴(kuò)增復(fù)雜模板————無(wú)可匹敵

3）退火溫度對(duì)條帶特異性的重要性

2、PCR反應(yīng)

1）推薦反應(yīng)體系

2）推薦反應(yīng)參數(shù)

3、應(yīng)用

1）基因定點(diǎn)突變；2）測(cè)序；3）蛋白表

注意事項(xiàng)：

1）HiFi Buffer中鹽離子濃度較高，影響DNA變性/退火，所以復(fù)雜模板需要較長(zhǎng)的變性溫度，5分鐘；GC Buffer主要針對(duì)高GC或穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的模板，僅當(dāng)HiFi Buffer效果不佳時(shí)使用，但其會(huì)降低保真性；

2）每個(gè)循環(huán)中變性條件為：98℃20s；

3）退火溫度需通過(guò)梯度PCR優(yōu)化得到；根據(jù)Tm值設(shè)定的退火溫度，然后若要增加靈敏度可每次提高1℃，若要提高特異性每次降低1℃；

4）推薦延伸時(shí)間：30s/kb；若模板濃度高，可降低延伸時(shí)間，但較長(zhǎng)的延伸時(shí)間會(huì)增加實(shí)驗(yàn)的靈敏度和產(chǎn)量；

5）推薦25個(gè)或更少的循環(huán)數(shù)，若起始模板濃度低或擴(kuò)增效率偏低導(dǎo)致產(chǎn)量不高，可增加至30-35個(gè)循環(huán)；

6）該體系可擴(kuò)增≥10kb的目的基因片段。若實(shí)驗(yàn)對(duì)MgCl2有特殊要求，請(qǐng)進(jìn)行梯度試驗(yàn)，每次增加或減少0.25mM；

7）根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求可調(diào)整HiFi酶的濃度，范圍：0.25U-1.0U/25μl；

8）末端加A，HiFi高保真酶擴(kuò)增產(chǎn)物是平末端，若要連接到T載體上，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后用KAPA Taq DNA酶進(jìn)行72℃延伸，因?yàn)槲醇兓漠a(chǎn)物中含有HiFi酶，其校對(duì)活性影響加A效果。

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